多重PCR(multiplex Polymerase Chain Reaction，mPCR)也称复合PCR，由Chambehian'于1988年首次提出。其基本原理与常规PCR相同，区别在于多重PCR反应体系加入一对以上引物，各对引物分别结合在模板相对应部位，最终扩增出一条以上目的DNA片段（图1）。

图1. 多重PCR原理

多重PCR可以通过优化反应体系和反应条件提高扩增的片段数量。理论上只要PCR扩增的条件合适，引物对的数量可以不限。另外，多重PCR在引物和反应条件的设计方面表现出很大的灵活性，既有单个PCR的特异性和敏感性，又较之快捷和经济，自提出以来已被广泛应用于包括核酸诊断在内的诸多领域（图2）。

图2 . 多重PCR的应用

需要指出的是多重PCR实验并不是简单地将多对特异性引物混合成一个反应体系。多重PCR之所以难，在于多个靶点之间扩增条件不兼容，每个靶点都需要旁边其他的引物配合。举个例子，就像“绑腿赛跑”（图3）。

图3. 绑腿赛跑

每个靶点的成功扩增都需要被捆绑在一起的两个人（一对引物）配合默契。而多重PCR就需要多对选手同时起跑又同时到达，并且所有参赛的每对选手都有最好的，而且均衡的发挥。

因此，多重PCR实际操作过程中的扩增效果和实际扩增的片段数目往往不尽如人意。而为了达到更好的扩增效果，一般我们可以通过以下几个方面进行优化：

2.1 引物

多重PCR实验中要求加入的多对引物既不能互相结合，也不能与模板DNA上目标片段以外的区域结合。另外传统的多重PCR实验中，为了使结果便于凝胶检测，还需设计不同扩增子片段大小不一。更麻烦的是，多重PCR中的不同扩增片段还会互相竞争资源，其结果是高丰度模板能够被很容易的检测到，而低丰度的模板彻底沦为背景。因而引物设计除了遵循一般的规则之外，还需要注意以下几点：

a. 引物特异性：

各引物与其它扩增片段不能存在较大的互补性，扩增片段之间也不能有较大同源性；

b. 引物长度：

一般18-24碱基，各引物之间不能互补，尤其避免3’端互补。较长的引物更易形成二聚体；

c. 退火温度：

退火温度选择标准：提高每一对引物的退火温度，然后在mPCR的时候采取最低退火温度；

d. 引物结构设计：

通过一些独特的结构设计，避免非特异性扩增或者引物二聚体。比如Ω引物（如图3），该引物包括三部分，5’端的序列，Ω环，3’端序列。其中两端的序列是和目标区域互补的，而环不是。对于Ω引物，当5端和3端序列完全配对才可以进行目标区段扩增，否则其结构不稳定（因为Ω环存在），导致扩增失败。

图4：Ω源联川生物图

常用引物设计网址:

http://www.premierbiosoft.com/primerplex/index.html

https://www.dna.utah.edu/umelt/umb.php

http://people.ds.cam.ac.uk/ssb22/pooler/(only for cancer researchers)

2.2 反应体系

多重PCR的反应体系也是影响扩增效果的重要因素之一，体系中的各组分需满足每对引物对应的靶点的扩增量的要求。反应体系包括引物、模板、缓冲液、DNA聚合酶、dNTP和Mg²⁺等，其作用与优化方法如下表1所示。

表1. 反应体系的优化

注：本文中DNA聚合酶以Taq DNA聚合酶为例。具体实验中，还可以在反应体系中适当增加浓度为5%的DMSO或者5% 的甘油等辅助剂，有利于提高扩增效率以及特异性。

2.3 反应条件

多重PCR反应中会存在以下两种问题：1）目的产物长度不尽相同，而较小片段总是优先得到扩增；2）各对引物的最佳PCR条件也不尽相同，比如较长片段需要更长的延伸时间。因此为了保证最终扩增产物的量尽可能的一致，在优化反应条件的时候，尽可能选择有利于较大片段扩增的条件，见表2。

表2. 反应条件的优化

3. 常见问题解决办法

多重PCR扩增的时候最主要的问题：二聚体、非特异性扩增以及扩增产物条带较弱。

表3. 常见问题解决办法

多重PCR要求在同一反应体系内对多个位点进行特异性扩增。因而引物间的配对与竞争性扩增均会影响扩增效果。如果能选择合适的反应体系以及反应条件则有望提高多重PCR的扩增效果。所以在进行多重PCR的时候，不应墨守陈规，要根据自身实验情况对实验条件进行不断优化，达到最佳扩增效果。