近十年以来，靶向肿瘤细胞DNA损伤反应的异常或缺失在癌症治疗中取得了有效进展。其中，PARP1抑制剂在BRCA1突变患者中取得的成功加速了其他DNA修复或复制应激（replication stress）靶向抑制剂的研究【1】。目前，靶向DNA损伤反应相关的ATM激酶，DNA-PK激酶，ATR激酶等的抑制剂正处于临床试验。当发生DNA双链断裂后，ATM激酶能够通过磷酸化组蛋白H2AX等调节DNA同源重组修复和非同源连接修复。但值得注意的是， ATM激酶在代谢中也发挥着重要的作用，如氧化还原应激，戊糖磷酸途径的调节等等【2-3】。具体来讲，ATM激酶可通过磷酸化HSP27，调节戊糖磷酸途径中的关键酶葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）的活性，从而调节NADPH的生成【4】。另外， ATM激酶可通过磷酸化转录因子NRF1调节细胞核内线粒体基因的表达，从而调节ATP的合成【5】。因此，此前的ATM激酶抑制剂临床前研究中出现的耐药性，可能是因为癌细胞代谢途径的重编程（metabolic reprogramming）。

近日，来自NIH的Prof. Weyemi研究组在PNAS杂志发表了研究成果CRISPR metabolic screen identifies ATM and KEAP1 as targetable genetic vulnerabilities in solid tumors（博士生李浩健为第一作者）。

该研究为了揭示导致ATM抑制剂耐药性的代谢途径，采用CRISPR screen筛选三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231中可能造成DNA损伤响应激酶Ataxia-telangiectasia-mutated（ATM）抑制剂耐药性的代谢相关基因。筛选结果发现，Kelch-like ECH-associated protein 1（KEAP1）的缺失能够使癌细胞对ATM抑制剂更加敏感（图1a）。研究者进一步通过动物实验验证了KEAP1敲除和同时抑制ATM激酶可导致合成致死。首先，研究组采用小鼠尾部静脉注射癌细胞的方法建立了基于MDA-MB-231细胞的免疫缺陷小鼠（NOD SCID gamma）癌症转移模型，该模型可通过IVIS活体成像观察肿瘤在小鼠中的进展。当肿瘤在小鼠肺部形成后，研究者通过给小鼠口服ATM激酶抑制剂AZD0156或AZD1390的方式给药。研究者观察到相比于KEAP1野生对照组，KEAP1敲除组细胞在给药后，在肺中的进展显著降低（图1b-c）。在停止给药后，接受ATM激酶抑制剂治疗的小鼠存活率显著提高（图1d）。给药7周后的小鼠肺部组织H&E染色显示KEAP1敲除组的肿瘤在给药后显著降低（图1e）。此外，由于KEAP1在非小细胞肺癌中的突变率高达15.8%，研究者采用非小细胞肺癌细胞系NCI-H1299皮下注射建立免疫缺陷小鼠的肿瘤模型。利用该模型，研究者发现当结合Keap1敲低和口服给药时，小鼠的皮下肿瘤体积和重量显著下降（图1f）。

图1. 体外和体内实验验证 ATM激酶和KEAP1蛋白可作为癌症治疗的靶点。

在体外和体内实验验证了ATM和KEAP1的合成致死现象之后，背后的机制也逐渐浮出水面。KEAP1是泛素连接酶Cullin3的底物识别的适配器，其主要的底物为Nrf2蛋白，而Nrf2作为转录因子控制着超过200个与细胞氧化还原应激相关的解毒酶和抗氧化酶。当KEAP1被敲除时，Nrf2泛素化水平降低，导致下游的基因被转录激活。Nrf2通路成员之一的溶质载体家族 7 成员 11基因（SLC7A11），是胱氨酸/谷氨酸逆向转运蛋白，能够促进细胞的胱氨酸的摄取，从而增加细胞中的谷胱甘肽的合成。近年来研究表明，SLC7A11高表达癌细胞在摄取大量胱氨酸，并同时缺失NADPH后积累二硫化物应激（disulfide stress），从而导致细胞死亡【6-7】。与之相应的，研究者发现在KEAP1敲除后， SLC7A11蛋白水平得以激活，而当进一步抑制ATM激酶活性时，细胞中的NADPH含量则开始下降，从而导致反应细胞中二硫化物应激水平的GSSG含量亦显著上升以及GSH/GSSG比例下降。当研究人员用还原剂TCEP处理细胞去除二硫键时， GSH/GSSG水平和细胞存活率得到明显回升。由于TCEP处理只能部分恢复细胞的存活率，细胞内可能存在其他的致死机制。但当抑制ATM激酶时，研究人员并未发现KEAP1敲除细胞中的组蛋白H2AX磷酸化与WT细胞存在显著差异，而且抑制ATR激酶和DNA-PK激酶与KEAP1敲除亦不存在合成致死。因此，该研究中KEAP1敲除和抑制ATM激酶的合成致死的机制可能为SLC7A11激活与NADPH水平下降导致的二硫化物应激（图2），而非DNA损伤的累积或DNA修复通路的异常。

图2. 靶向ATM激酶与KEAP1蛋白的合成致死机制

综上所述，该研究发现了ATM激酶和KEAP1蛋白可作为癌症治疗的靶点，为癌症组合治疗提供了新的思路。KEAP1在所有癌症中的突变率在3.93%，尤其在非小细胞肺癌中的突变率为15.8%，本研究或为ATM激酶抑制剂在这些KEAP1突变或Nrf2通路激活的肿瘤中的应用提供依据。

https://doi.org/10.1073/pnas.2212072120

参考文献

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（来源：BioArtMED）